{"id":2530,"date":"2024-11-05T12:00:55","date_gmt":"2024-11-05T19:00:55","guid":{"rendered":"https:\/\/help.lichenportal.org\/?page_id=2530"},"modified":"2024-11-06T12:35:44","modified_gmt":"2024-11-06T19:35:44","slug":"flujo-de-trabajo-para-la-analisis-de-metabolitos-secundarios","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/es\/flujo-de-trabajo-para-la-analisis-de-metabolitos-secundarios\/","title":{"rendered":"Flujo de Trabajo para la An\u00e1lisis de Metabolitos Secundarios de L\u00edquenes"},"content":{"rendered":"\n<p class=\"has-large-font-size\"><strong>Identificaci\u00f3n de Metabolitos Secundarios Liqu\u00e9nicos por Cromatograf\u00eda en Capa Fina<\/strong> (CCF)<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Frank Bungartz<\/strong><sup>1,2,3<\/sup>, <strong>Alba Y\u00e1nez-Ayabaca<\/strong><sup>3,4,5<\/sup> y <strong>Mar\u00eda de los \u00c1ngeles Herrera-Campos<\/strong><sup>6<\/sup><\/p>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\" style=\"margin-bottom:0\"><sup>1<\/sup><em>Biodiversity Integration Knowledge Center<\/em>, Arizona State University, PO Box 874108, Arizona State University, Tempe, AZ 85287-4108, USA<br><sup>2<\/sup>Charles Darwin Foundation for the Galapagos Islands, Puerto Ayora, Ecuador<br><sup>3<\/sup>Instituto Nacional de Biodiversidad (INABIO), Quito, Ecuador<br><a href=\"mailto:frank.bungartz@asu.edu\">frank.bungartz@asu.edu<\/a><\/p>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\" style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\"><sup>4<\/sup><em>Universidad Central del Ecuador<\/em>, Ciudadela Universitaria, Jer\u00f3nimo Leyton s\/n, Quito, Ecuador<br><sup>5<\/sup>Herbario Nacional del Ecuador, Quito, Ecuador<br><a href=\"mailto:albayanez8@gmail.com\">albayanez8@gmail.com<\/a><\/p>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\" style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\"><sup>6<\/sup>Departamento de Bot\u00e1nica, Instituto de Biolog\u00eda, Universidad Nacional Aut\u00f3noma de M\u00e9xico. Apartado Postal 70-367, 04510 M\u00e9xico, Cd. de M\u00e9xico, M\u00e9xico<br><a href=\"mailto:mahc@ib.unam.mx\">mahc@ib.unam.mx<\/a><\/p>\n\n\n\n<p class=\"has-medium-font-size\"><strong>Table Of Contents<\/strong><\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\">\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\" class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#intro\">Introducci\u00f3n<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\" class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#procedimiento\">Procedimiento<\/a>\n<ul class=\"wp-block-list\">\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#controles\">uso de controles<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#muestras\">preparacion de muestras<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#solventes\">preparacion de solventes<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#especiales\">solventes especiales<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#tanque\">preparacion del tanque<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#placas\">preparacion de las placas<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#corriendo\">corriendo las placas<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#manchas\">interpretacion de manchas<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\"><a href=\"#documentacion\">documentacion<\/a><\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\" class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#requerimientos\">requerimientos y suministros<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\" class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#resumen\">resumen<\/a><\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:0;margin-bottom:0\" class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#literatura\">literatura y recursos<\/a><\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"intro\"><strong>Introducci\u00f3n<\/strong><\/h2>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Las sustancias liqu\u00e9nicas son productos org\u00e1nicos del metabolismo primario y del metabolismo secundario. Los primeros son producidos por el fotobionte y el micobionte y se depositan intracelularmente, mientras que los segundos son productos f\u00fangicos, que se depositan en las paredes celulares e incluyen <em>para<\/em> y <em>meta<\/em>-depsidas, depsidonas, bencil \u00e9steres, dibenzofuranos, \u00e1cidos \u00fasnicos, xantonas, antraquinonas, terpenoides y \u00e1cido pulv\u00ednico y sus derivados y \u00e1cidos alif\u00e1ticos y son sintetizados a trav\u00e9s de tres v\u00edas metab\u00f3licas secundarias: v\u00eda acetato-malonato, v\u00eda del \u00e1cido siqu\u00edmico y v\u00eda del \u00e1cido meval\u00f3nico. Se conocen alrededor de 700 metabolitos secundarios liqu\u00e9nicos, de los cuales entre 50 y 60 tambi\u00e9n han sido encontrados en hongos no liquenizados y \/o en plantas vasculares.<\/p>\n\n\n\n<p>La cromatograf\u00eda en capa fina CCF (TLC por sus siglas en ingl\u00e9s) es una t\u00e9cnica relativamente simple, no muy costosa y probablemente la m\u00e1s utilizada para la identificaci\u00f3n de las sustancias liqu\u00e9nicas, sin embargo no es suficientemente sensible para detectar aqu\u00e9llas presentes en bajas concentraciones que frecuentemente no son evidentes en la placa cromatogr\u00e1fica.<\/p>\n\n\n\n<p>El m\u00e9todo consiste, de manera general, en correr el extracto acet\u00f3nico de las sustancias liqu\u00e9nicas en una placa cromatogr\u00e1fica con un solvente que se desplaza por capilaridad a lo largo de la misma. Las sustancias se separan en la placa de acuerdo a su afinidad por el solvente y se evidencian como manchas de diferentes caracter\u00edsticas bajo luz visible y luz ultravioleta de onda corta y larga antes y despu\u00e9s de un proceso de revelado en \u00e1cido sulf\u00farico a alta temperatura en un horno de laboratorio<\/p>\n\n\n\n<p>Las caracter\u00edsticas de estas manchas que deben ser registradas para identificar las sustancias liqu\u00e9nicas son la distancia que recorre cada una en la placa a partir del origen o l\u00ednea base y su color al observarlas bajo luz visible y UV.<\/p>\n\n\n\n<p>La distancia recorrida por las manchas puede ser expresada como el valor Rf (valor de retenci\u00f3n), cuyo valor absoluto puede variar debido a las condiciones particulares de cada laboratorio. Para evitar estas variaciones, se dividen las placas cromatogr\u00e1ficas por valores Rf, tomando como referencia sustancias controles valores Rf conocidos como el \u00e1cido norest\u00edctico y la atranorina (Fig. 1). Otra posibilidad es no usar los valores absolutos, sino calcular los valores Rf relativos con la siguiente f\u00f3rmula<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-full\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"746\" height=\"180\" src=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-9.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-2708\" srcset=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-9.png 746w, https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-9-300x72.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 746px) 100vw, 746px\" \/><\/figure>\n\n\n\n<p>El color de las manchas en luz visible y ultravioleta de onda larga (366 nm) y onda corta (254 nm) es com\u00fanmente diferente bajo cada una. Muchas sustancias tienen fluorescencia caracter\u00edstica bajo la luz UV que incluso puede ser observada a\u00fan antes del proceso de revelado con el \u00e1cido sulf\u00farico. De hecho, casi todas las sustancias son visibles como manchas obscuras al exponer la placa a luz UV de onda corta, pero al observarla bajo UV de onda larga s\u00f3lo algunas fluorescen de manera caracter\u00edstica, lo cual puede cambiar despu\u00e9s del tratamiento con \u00e9l \u00e1cido sulf\u00farico.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-full is-resized\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"778\" height=\"495\" src=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-1.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-2536\" style=\"width:840px;height:auto\" srcset=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-1.png 778w, https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-1-300x191.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 778px) 100vw, 778px\" \/><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><strong>Figura 1.<\/strong> Divisi\u00f3n de la placa por clases Rf en funci\u00f3n de atranorina y \u00e1cido norest\u00edctico como controles &nbsp;Las sustancias &nbsp;con un Rf igual al \u00e1cido norest\u00edctico pertenecen a la clase de Rf 4 y las sustancias con un Rf parecido a atranorina a la clase 7. Las sustancias con Rf de 0 (b\u00e1sicamente no saliendo del origen de la placa) pertenecen a la clase 1. Seg\u00fan estos controles la regi\u00f3n entre 1 y 4 se divide en las clases 2 y 3 y el \u00e1rea entre 4 y 7 contiene las clases 5 y 6. Cualquier sustancia que suba por arriba de Rf7 pertenece a la clase Rf 8.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"procedimiento\"><strong>Procedimiento<\/strong><\/h2>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"controles\"><strong>(1) Uso de controles y\/o ejemplares de qu\u00edmica conocida para comparar<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Se recomienda usar la atranorina y el \u00e1cido norest\u00edctico como controles generales, aunque se pueden agregar otros para ayudar a la identificaci\u00f3n de las manchas. Estos controles pueden ser extractos espec\u00edficos purificados industrialmente o muestras de l\u00edquenes cuya qu\u00edmica secundaria es conocida.<\/p>\n\n\n\n<p>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Generalmente, para verificar si una sustancia espec\u00edfica est\u00e1 presente en una muestra, es \u00fatil correr una muestra cuya qu\u00edmica se desconoce al lado de una muestra con qu\u00edmica conocida para compararlas. Por ejemplo, en muchas regiones tropicales <em>Pseudocyphellaria aurata<\/em> es un liquen muy com\u00fan. El amarillo de su m\u00e9dula corresponde al \u00e1cido pulv\u00ednico. Para verificar que \u00e9ste tambi\u00e9n est\u00e1 presente en otro liquen con pigmento amarillo intenso se puede correr directamente al lado de <em>Pseudocyphellaria aurata<\/em>. A veces este procedimiento de comparar muestras conocidas con muestras desconocidas es m\u00e1s f\u00e1cil, m\u00e1s r\u00e1pido y m\u00e1s confiable que analizar las placas solamente seg\u00fan sus valores o clases de Rf.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"muestras\"><strong>(2) Preparaci\u00f3n de muestras<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Al estereoscopio, se toma una peque\u00f1a porci\u00f3n del liquen, seca y libre de sustrato y se coloca en un vial numerado, <em>\u00a1<\/em>asegur\u00e1ndose no colocar una mezcla de diferentes especies<em>!<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>A temperatura ambiente, se a\u00f1ade a cada vial una gota de acetona o lo estrictamente necesario para cubrir la muestra. Para muestras muy absorbentes o de extractos muy p\u00e1lidos se requerir\u00e1n gotas adicionales que se agregan conforme las anteriores se evaporen. Algunas sustancias secundarias de los l\u00edquenes disuelven muy r\u00e1pido en acetona y generalmente despu\u00e9s de dos o tres minutos de a\u00f1adir la acetona, los extractos est\u00e1n listos para ser analizados. Sin embargo algunas sustancias secundarias son poco solubles y en este caso poner los tubos de extracci\u00f3n con la muestra y el acetona en un ba\u00f1o de agua hirviendo por algunos segundos puede significativamente mejorar la extracci\u00f3n aunque es muy importante que no se aplica el calor por mucho tiempo.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"solventes\"><strong>(3) Preparaci\u00f3n de los solventes<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Se utilizan distintas mezclas de solventes -en proporciones indicadas a continuaci\u00f3n entre ( )-y deben ser preparadas en peque\u00f1as cantidades dentro de una campana de extracci\u00f3n de vapores utilizando cristaler\u00eda completamente limpia y seca.<\/p>\n\n\n\n<p><strong><em>Solvente A:<\/em><\/strong><em> tolueno\/dioxano\/\u00e1cido ac\u00e9tico (180:45:5):<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>El dioxano es una sustancia higrosc\u00f3pica que con el tiempo absorbe el agua, provocando que el solvente se deteriore dentro de unas semanas, por lo que se recomienda utilizarlo r\u00e1pidamente. En regiones tropicales con alta humedad ambiental es recomendable usarlo fresco.<\/p>\n\n\n\n<p><strong><em>Solvente B\u2019<\/em><\/strong><em>: hexano\/metil-tert-butil \u00e9ter\/\u00e1cido f\u00f3rmico (140:72:18):<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>En el procedimiento original se usa dietil \u00e9ter en vez de metil-tert-butil \u00e9ter. El dietil \u00e9ter es una sustancia muy peligrosa, por lo que ha sido reemplazada con el solvente B\u2019. El solvente B se echa a perder en menos de 6 horas, mientras que el B\u2019 puede ser utilizado durante cuatro o cinco d\u00edas. Por seguridad tambi\u00e9n se puede reemplazar el hexano por ciclohexano.<\/p>\n\n\n\n<p><strong><em>Solvente C<\/em><\/strong><em>: tolueno\/\u00e1cido ac\u00e9tico (170:30; o 200:30):<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>El solvente est\u00e1ndar para CCF de rutina; es ampliamente utilizado porque permite distinguir la mayor\u00eda de las sustancias qu\u00edmicas y es estable durante varias semanas.<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"especiales\"><strong><em>Solventes especiales<\/em><\/strong>:<\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Los solventes E y G son usados para diferenciar sustancias que no distinguibles con el uso de los solventes anteriores.<\/p>\n\n\n\n<p><strong><em>Solvente E<\/em><\/strong><em>: ciclohexano\/acetato de etilo (75:25)<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>El solvente E discrimina varios derivados no polares de compuestos liqu\u00e9nicos y sustancias cuyos valores Rf son muy altos en los solventes A, B, B\u2019 y C. Es necesario prepararlo diariamente.<\/p>\n\n\n\n<p><strong><em>Solvente G<\/em><\/strong><em>: tolueno\/acetato de etilo\/\u00e1cido f\u00f3rmico (139:83:8)<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>El solvente G discrimina con mejor resoluci\u00f3n metabolitos que salen con Rf bajo en otros solventes.<\/p>\n\n\n\n<p><strong><em>Solvente F<\/em><\/strong><em>: acetato de etilo \/ cyclohexano 1: 1 (Elix &amp; Crook 1992).<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>El solvente F se usa para analizar xantones, adem\u00e1s ayuda para distinguir atranorina de chloroatranorina.<\/p>\n\n\n\n<p>En caso de utilizar los solventes A y B, colocar un papel filtro en la cara posterior del tanque para ayudar a uniformizar su distribuci\u00f3n. Al introducir la placa en el tanque la superficie de s\u00edlica debe quedar de frente al papel.<\/p>\n\n\n\n<p>Raramente, se usan tambi\u00e9n otros solventes para una diferenciaci\u00f3n mejor de sustancias particulares como xantonas o terpenos lo cuales son generalmente m\u00e1s dif\u00edcil de analizar (Orange et al. 2010).<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"tanque\"><strong>(4) Preparaci\u00f3n del tanque<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Algunos autores recomiendan antes de utilizar los solventes B y C, prevenir el desarrollo de frentes secundarios colocando las placas con las muestras en un tanque con \u00e1cido f\u00f3rmico por cinco minutos (para el solvente B) y durante 10 minutos con \u00e1cido ac\u00e9tico glacial (para el C). Se debe evitar que dichos \u00e1cidos toquen la placa, por lo que han de usarse cuentas o viales de vidrio en el fondo del tanque para soportarla y de preferencia colocarla de manera invertida, con la l\u00ednea basal hacia arriba.<\/p>\n\n\n\n<p>Una vez preparada la mezcla a utilizar, en un tanque para cromatograf\u00eda se vac\u00eda una peque\u00f1a cantidad, que permita alcanzar 1 cm de profundidad. Se engrasa el borde del tanque con grasa silic\u00f3nica para sellarlo herm\u00e9ticamente y el solvente se deja reposar dos horas antes de usarlo.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"placas\"><strong>(5) Preparaci\u00f3n de las placas<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Las placas cromatogr\u00e1ficas m\u00e1s com\u00fanmente usadas para un tanque est\u00e1ndar miden 20 x 20 cm (para revisar las placas es importante comprarlas con un indicador de fluorescencia &nbsp;en luz de UV corta (F<sub>254<\/sub>), ej. Merck silica gel 60 F254 pre-coated 20 \u00d7 20 cm). Los tanques est\u00e1ndar son un jarr\u00f3n recto de vidrio que requiere una cantidad relativamente alta de solvente. Para ahorrar solvente es muy recomendable usar un tanque plano especial de HPTLC [High Performance Thin-layer Chromatography. Aunque el tanque es inicialmente m\u00e1s caro, a largo plazo representa un ahorro en la compra de solventes (tanques planos de HPTLC se puede comprar de <a href=\"https:\/\/www.camag.com\/product\/camag-horizontal-developing-chamber\" data-type=\"link\" data-id=\"https:\/\/www.camag.com\/product\/camag-horizontal-developing-chamber\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">CAMAG<\/a> o de <a href=\"https:\/\/www.carlroth.com\/com\/en\/accessories-for-thin-layer-chromatography\/horizontal-developing-chamber-for-tlc-biostep-%28desaga%29\/p\/286a.1\" data-type=\"link\" data-id=\"https:\/\/www.carlroth.com\/com\/en\/accessories-for-thin-layer-chromatography\/horizontal-developing-chamber-for-tlc-biostep-%28desaga%29\/p\/286a.1\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">DESAGA<\/a>). Las placas para HPTLC tienen un grano m\u00e1s fino de s\u00edlica, mejor resoluci\u00f3n y t\u00edpicamente miden solamente 10 x 10 cm.]<\/p>\n\n\n\n<p>En caso de que se analicen pocas muestras, es posible cortar las placas por el reverso pasando firmemente y una sola vez con un cortador y utilizando una regla como gu\u00eda. Cortar placas de vidrio generalmente no es f\u00e1cil y alternativamente se puede usar placas con una base de aluminio, tambi\u00e9n conocidas como cromatofolios, &nbsp;que pueden cortarse con tijera (<em>desventaja<\/em>: en estas placas no se puede ver manchas de \u00e1cidos grasos que solamente son observables en placas con una base de vidrio).<\/p>\n\n\n\n<p>A una distancia de 2cm del borde inferior de la placa, dibujar con l\u00e1piz <em>SUAVE<\/em> la l\u00ednea base de lado a lado, marcando ligeramente a cada cent\u00edmetro la posici\u00f3n donde se colocar\u00e1 cada muestra de los extractos. Si se desea, tambi\u00e9n se puede trazar otra l\u00ednea en la parte superior de la placa para indicar hasta d\u00f3nde llegar\u00e1 el frente del solvente (t\u00edpicamente a 10-15 cm&nbsp; de la l\u00ednea base; la resoluci\u00f3n de las manchas en la placa es generalmente mejor con la distancia, pero a mayor distancia los artefactos, como efectos del borde de la placa, son tambi\u00e9n m\u00e1s pronunciados).<\/p>\n\n\n\n<p>Con un tubo capilar, tomar una muestra del extracto acet\u00f3nico y cuidadosamente colocar una peque\u00f1a gota en el lugar correspondiente en la placa. No usar el mismo capilar para distintas muestras.<\/p>\n\n\n\n<p>Repetir el procedimiento hasta que una mancha de sustancia liqu\u00e9nica pueda distinguirse en la placa. Se puede asegurar que hay suficiente muestra si las manchas son evidentes al ver la placa por el reverso a contraluz (Fig. 2).<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"108\" src=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-2-1024x108.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-2537\" srcset=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-2-1024x108.png 1024w, https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-2-300x32.png 300w, https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-2.png 1824w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><strong>Figura 2. <\/strong>Reverso de la placa, l\u00ednea de origen vista a contraluz.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"corriendo\"><strong>(6) Corriendo las placas<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>La placa se coloca rectamente en el tanque y se deja correr el solvente, cuidando que el frente <em>\u00a1<\/em>no sobrepase el borde de la misma<em>!<\/em> <em>Una vez que el frente del solvente alcanza la distancia adecuada (10-15 cm), remover la placa del tanque y dejarla secar 30 minutos.<\/em><\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"manchas\"><strong>(7) Interpretaci\u00f3n de las manchas<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Un recurso bien \u00fatil para la analisis es el programa <a href=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/es\/analisis-de-metabolitos-secundarios\/\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">MYTABOLITES<\/a>, disponible para bajar con instrucciones detalladas directamente desde de la pagina <a href=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/en\/analysis-of-secondary-metabolites\/\" data-type=\"link\" data-id=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/en\/analysis-of-secondary-metabolites\/\">aqu\u00ed<\/a>. La base de datos incluido en el programa ayuda mucho en la interpretaci\u00f3n de placas de cromatograf\u00eda de capa fina para el an\u00e1lisis de metabolitos secundarios de l\u00edquenes.<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\"><em>Observaci\u00f3n \u00e1cidos grasos<\/em><\/h4>\n\n\n\n<p>A continuaci\u00f3n, la placa de vidrio seca se roc\u00eda con agua para detectar los \u00e1cidos grasos, los cuales ser\u00e1n visibles como manchas blancas opacas en el fondo h\u00famedo y transl\u00facido de la placa. Trazar un c\u00edrculo alrededor de la mancha y cruzarlo. Resulta de utilidad observar la placa contra una superficie negra.<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\"><em>Observaci\u00f3n en luz UV antes de hornear con H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub><\/em><\/h4>\n\n\n\n<p>Nuevamente permitir que la placa se seque y observarla bajo UV de onda corta y encerrar cada mancha en un c\u00edrculo. Inmediatamente, observarla bajo UV de onda larga y marcar con un c\u00edrculo punteado cada mancha, registrando el color, la presencia de halos y la intensidad de la fluorescencia con +, ++, +++. En el caso de manchas obscuras, colocar un <strong>\u2013<\/strong> en el centro del c\u00edrculo punteado (esta documentaci\u00f3n es necesario especialmente cuando no es posible documentarlo con fotograf\u00eda digital).<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\"><em>Tratamiento con H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub><\/em><\/h4>\n\n\n\n<p>Una vez registrada la informaci\u00f3n anterior, aplicar \u00e1cido sulf\u00farico al 10% a la placa y dejarla secar para meterla al horno a 100 o 110\u00b0C durante 8 minutos aproximadamente, cuidando que la placa no se queme y revisando el desarrollo de los colores de las manchas, los cuales deben aparecer n\u00edtidos.<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\"><em>Observaci\u00f3n en luz visible y en luz UV despu\u00e9s de hornear con H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub><\/em><\/h4>\n\n\n\n<p>En cuanto se revelan las manchas coloridas, sacar la placa del horno, dejarla enfriar y registrar sus colores bajo luz visible. Repetir la lectura bajo UV larga y registrar cambios de color de manchas ya detectadas y\/o las caracter\u00edsticas de manchas nuevas.<\/p>\n\n\n\n<p>Algunos colores pueden cambiar r\u00e1pida o lentamente, por lo que se recomienda revisar la placa repetidamente despu\u00e9s de un tiempo y anotar los cambios.<\/p>\n\n\n\n<h4 class=\"wp-block-heading\"><em>Identificaci\u00f3n de las sustancias secundarias<\/em><\/h4>\n\n\n\n<p>Con la informaci\u00f3n obtenida durante los diferentes pasos de la CCF es posible identificar para la gran mayor\u00eda de las sustancias: la clase Rf, el Rf relativo, su presencia o ausencia en luz UV antes de hornear, el color despu\u00e9s en luz UV y luz visible. Asimismo, se puede a\u00f1adir la informaci\u00f3n de las pruebas de tinci\u00f3n y fluorescencia del ejemplar de liquen para identificar las sustancias presentes.<\/p>\n\n\n\n<p>Generalmente la interpretaci\u00f3n de las placas para la identificaci\u00f3n de las sustancias secundarias es el paso m\u00e1s dif\u00edcil en el an\u00e1lisis y no siempre es posible identificar todas las manchas correctamente. Todav\u00eda hay varias sustancias desconocidas y el descubrimiento de nuevas contin\u00faa hasta la fecha.<\/p>\n\n\n\n<p>En la mayor\u00eda de casos la CCF rutinaria es suficiente para confirmar la presencia o ausencia de una sustancia espec\u00edfica en un ejemplar. Dicho ejemplar es identificado preliminarmente y se sabe que tal especie est\u00e1 caracterizada por la presencia de una sustancia caracter\u00edstica, por lo que para confirmar la identificaci\u00f3n no se requiere m\u00e1s que una cromatograf\u00eda en el solvente est\u00e1ndar C, corriendo la muestra problema al lado de la muestra con sustancias conocidas para verificar su presencia en ambas y saber si son id\u00e9nticas o no. En otros casos, cuando se trata de sustancias menos conocidas, frecuentemente es necesario correr los extractos en distintos solventes.<\/p>\n\n\n\n<p>La variaci\u00f3n de las condiciones en el laboratorio, la extracci\u00f3n, la aplicaci\u00f3n en las placas, la humedad, la edad del solvente, la pureza de los reactivos y muchos otros factores pueden causar que los valores Rf relativo calculados no coincidan con las valores est\u00e1ndar. Por ejemplo, el Rf relativo est\u00e1ndar de los controles del \u00e1cido norest\u00edctico en C es 30 y el de la atranorina es 79. Si los valores reales de estos controles muestran una discrepancia, es necesario ajustar tambi\u00e9n todos los valores de las otras sustancias encontradas en la placa.<\/p>\n\n\n\n<p>El c\u00e1lculo y el registro de los valores Rf relativos para cada mancha pueden hacerse con el programa WinTab 64bit. Este programa incluye una base de datos enorme de valores Rf relativos de las manchas, colores y fluorescencias caracter\u00edsticas antes y despu\u00e9s del tratamiento con H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub>. Tambi\u00e9n permite calcular el Rf y ajustar (\u2018cune\u201d) los valores si \u00e9stos no siguen el est\u00e1ndar en la base de datos del programa. El programa es \u00fatil para generar autom\u00e1ticamente sugerencias de posibles sustancias, pero la estandarizaci\u00f3n e interpretaci\u00f3n de los colores es todav\u00eda problem\u00e1tica y limitada. La interpretaci\u00f3n de un color generalmente depende del observador y es subjetivo, lo cual tambi\u00e9n ocurre cuando se utiliza informaci\u00f3n publicada (Elix 2018). Adem\u00e1s, variaciones experimentales como el tiempo de horneado y la concentraci\u00f3n de la sustancia afectan el desarrollo del color de mancha. Muchas manchas tienen una franja de diferente color que es caracter\u00edstica, un detalle no usado en el programa.<\/p>\n\n\n\n<p>Una vez digitalizada la placa, es te\u00f3ricamente posible usar programas como Adobe Photoshop con su \u201ccolor picker\u201d para medir exactamente los valores RGB de un color y para la interpretaci\u00f3n es muy recomendable establecer un registro digital de im\u00e1genes de las placas de CCF.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"documentacion\">(8) Documentaci\u00f3n<\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>Al paso del tiempo, los colores de las manchas en las placas palidecen gradualmente, por lo que se sugiere guardarlas en protectores de hojas y escanearlas o tomar fotograf\u00edas digitales para una buena documentaci\u00f3n. Con una c\u00e1mara digital es posible preservar las im\u00e1genes de las placas en luz visible y en luz UV antes y despu\u00e9s del tratamiento con H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub>. Esta documentaci\u00f3n facilita mucho la interpretaci\u00f3n del an\u00e1lisis. Por ejemplo, en lugar de utilizar diferentes s\u00edmbolos para marcar las manchas en las placas, se pueden colocar las diferentes fotos lado a lado y as\u00ed documentar en detalle todos las diferentes reacciones: (1) directamente despu\u00e9s del corrimiento y antes del tratamiento con H<sub>2<\/sub>O<sub>2<\/sub> en luz UV de onda larga, (2) en luz UV de onda corta, (3) despu\u00e9s del tratamiento con H<sub>2<\/sub>O<sub>2<\/sub> en luz UV corta y (4) en luz visible (Fig. 3).<\/p>\n\n\n\n<p>Es recomendable conservar los viales o tubos Eppendorf con el extracto, en caso de requerir repetir el an\u00e1lisis con distintos solventes.<\/p>\n\n\n\n<p>Una vez analizadas las muestras, deber\u00e1 anotarse la informaci\u00f3n de las sustancias identificadas e incorporarla al sobre con el ejemplar analizado.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"1011\" src=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-3-1024x1011.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-2538\" srcset=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-3-1024x1011.png 1024w, https:\/\/help.lichenportal.org\/wp-content\/uploads\/2024\/11\/image-3-300x296.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><strong>Figura 3.<\/strong> Comparaci\u00f3n de una placa de HPTLC en solvente C, en luz visible con luz UV de diferentes ondas ( l 254 y 365 nm) antes y despu\u00e9s de tratamiento con H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub> y quema en el horno del laboratorio.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"requerimientos\">(9) <strong>Requerimientos y Suministros<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\">\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Campana de extracci\u00f3n de vapores, horno de laboratorio, estereoscopio<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">L\u00e1mpara de luz ultravioleta de onda larga (\u03bb 365 nm) y onda corta (\u03bb 254 nm)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Placas de vidrio y\/o aluminio para cromatograf\u00eda en placa fina cubiertas con s\u00edlica gel amorfo y con indicador de fluorescencia (\u03bb 254 nm)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Tanques de vidrio con tapa para cromatograf\u00eda (o tanque plano de HPTLC)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Papel filtro (para cara posterior del tanque, si se usa solvente A o B; no necesario para HPTLC)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Grasa de s\u00edlica (para sellar el tanque; no necesario para HPTLC)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Cristaler\u00eda (matraces, pipetas, probetas, vasos de precipitado)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Tubos capilares, viales o tubos Eppendorf<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Gradilla, L\u00e1piz suave<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Reactivos: acetona (para extraer); para las solventes &#8211; acetato de etilo, ciclohexano, dioxano, hexano, metil-tert-butil-\u00e9ter, tolueno. \u00c1cidos: ac\u00e9tico, ac\u00e9tico glacial, f\u00f3rmico y sulf\u00farico (10%)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Esponja, brocha fina o rociador para aplicaci\u00f3n de 10% H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub> (se necesita una campana de extracci\u00f3n y gafas de protecci\u00f3n si se usa rociador), guantes<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Agua destilada en rociador, cartoncillo negro (o superficie obscura para la observaci\u00f3n de \u00e1cidos grasos)<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">Sustancias control o ejemplares de l\u00edquenes de qu\u00edmica conocida<\/li>\n\n\n\n<li style=\"margin-top:var(--wp--preset--spacing--20);margin-bottom:var(--wp--preset--spacing--20)\">C\u00e1mara digital (o esc\u00e1ner)<\/li>\n<\/ul>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading has-medium-font-size\" id=\"resumen\">(10) <strong>Resumen corto de procedimientos (indicando las pausas posibles)<\/strong><\/h3>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>(1) <strong>Extracci\u00f3n de las muestras con acetona en tubos Eppendorf<\/strong> (posible pausa: varios d\u00edas, una vez las muestras est\u00e1n dentro de los tubos se puede guardarlas indefinidamente y aplicar acetona otra vez cuando el extracto se necesite).<\/p>\n\n\n\n<p>(2) <strong>Preparar placas y aplicar extracciones<\/strong> (posible pausa: se puede guardar las placas en un lugar seco por unos d\u00edas).<\/p>\n\n\n\n<p>(3) <strong>Preparaci\u00f3n del tanque y del solvente<\/strong> (pausa <em>no<\/em> posible: para la mayor\u00eda de los solventes es mejor prepararlos fresco y utilizarlos el mismo d\u00eda).<\/p>\n\n\n\n<p>(4) <strong>Corrimiento y lectura de las placas <\/strong>(inmediatamente despu\u00e9s de la evaporaci\u00f3n completa de las solventes en <a><\/a><a>UV de onda larga (\u03bb 365 nm)<\/a> y onda corta (\u03bb 254 nm); aplicaci\u00f3n de H<sub>2<\/sub>O para visualizaci\u00f3n de \u00e1cidos grasos; documentaci\u00f3n en luz UV con fotos; pausa <em>no<\/em> posible).<\/p>\n\n\n\n<p>(5) <strong>Aplicaci\u00f3n de H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub><\/strong>; secar completamente; <strong>colocar las placas en horno de laboratorio<\/strong> (100-110\u00baC, t\u00edpicamente 8 minutos, pero revisar el color de las manchas; pausa <em>no<\/em> posible)<\/p>\n\n\n\n<p>(6) <strong>Lectura de las placas despu\u00e9s de H<sub>2<\/sub>SO<sub>4<\/sub> y horneado<\/strong>: luz visible, luz UV de onda corta (\u03bb 254 nm); toma de fotos (pausa <em>no<\/em> posible: las colores empiezan cambiar inmediatamente despu\u00e9s y son m\u00e1s caracter\u00edsticos en cuanto se saca del horno, cuando la placa est\u00e1 suficiente fr\u00eda para tocarla; algunas manchas cambian el color caracter\u00edsticamente en unos 20-30 minutos despu\u00e9s, <em>\u00a1<\/em>anotar estos cambios<em>!<\/em>).<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading has-large-font-size\" id=\"literatura\"><strong>Literatura<\/strong> y Recursos<\/h2>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p><em>La informaci\u00f3n m\u00e1s amplia y m\u00e1s actual sobre el an\u00e1lisis microqu\u00edmico se encuentra en:<\/em><\/p>\n\n\n\n<p><strong>Orange, A, James, PW &amp; White, FJ<\/strong> (2010) <em>Microchemical methods for the identification of lichens, second edition with additions and corrections. <\/em>British Lichen Society, London. <em>Second edition with additions and corrections<\/em>. Published by the British Lichen Society, available for download <a href=\"https:\/\/britishlichensociety.org.uk\/sites\/default\/files\/document-downloads\/Orange%20Microchemical%20Methods.pdf\">here<\/a>.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Elix, JA<\/strong> (2022) Catalogue of standardized chromatographic data and biosynthetic relationships for lichen substances. <em>Sixth Edition.<\/em> Published by the author, Canberra, available for download <a href=\"https:\/\/www.anbg.gov.au\/abrs\/lichenlist\/TLC%20Cat%206MC.pdf\">here<\/a>.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Lafferty, D., Bungartz, F., Elix, J.A. &amp; Schumm, F.<\/strong> (2024) <em>Mytabolites <\/em>\u2013 a program developed at Arizona State University for the interpretation thin-layer chromatography plates, for the analysis of secondary metabolites from lichens, based on an original concept published by E. Mietzsch, H.T. Lumbsch &amp; J.A. Elix. <em>Help &amp; Resources for the Consortium of Lichen Herbaria<\/em>, available at <a href=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/en\/analysis-of-secondary-metabolites\/\">https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/en\/resources\/metabolites\/<\/a><\/p>\n\n\n\n<p>El programa <a href=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/es\/analisis-de-metabolitos-secundarios\/\" data-type=\"page\" data-id=\"1837\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">MYTABOLITES<\/a> se puede bajar <a href=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/en\/analysis-of-secondary-metabolites\/\" target=\"_blank\" rel=\"noreferrer noopener\">aqu\u00ed<\/a>.<\/p>\n\n\n\n<p>_______________________________________________________________________________________<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading has-large-font-size\"><strong>Otras Referencias<\/strong><\/h2>\n\n\n\n<p class=\"has-small-font-size\"><a href=\"#top\"><\/a><a href=\"#top\">\u2191 volver al inicio<\/a><\/p>\n\n\n\n<p><strong>Nylander W<\/strong> (1867) Hypochlorite of lime and hydrate of potash, two new criteria in the study of lichens. <em>Linnean Society&#8217;s Journal of Botany<\/em> <strong>9<\/strong>: 357-365.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>White FJ, James PW<\/strong> (1985) New Guide to microchemical techniques for the identification of lichen substances. <em>Bulletin British Lichen Society<\/em> <strong>57<\/strong>: 41.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson CF<\/strong> (1972) Improved conditions and new data for the identification of lichen products by a standardized thin-layer chromatographic method. <em>Journal of Chromatography<\/em> <strong>72<\/strong>: 113-125.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson CF, Kristinsson HD<\/strong> (1970) A standardized method for the identification of lichen products.<em> Journal of Chromatography<\/em> <strong>46<\/strong>: 85-93.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson CF, Culberson WL, Johnson A<\/strong> (1981) A standardized TLC analysis of \u03b2-orcinol depsidones. <em>Bryologist <\/em><strong>84<\/strong>: 16-29.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson, CF, Ammann, K<\/strong> (1979) Standardmethode zur D\u00fcnnschichtchromatographie von Flechtensubstanzen. <em>Herzogia<\/em> <strong>5<\/strong>: 1-24.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson CF, Johnson A<\/strong> (1982) Substitution of methyl tert-butyl ether for diethyl ether in the standardized thin-layer chromatic method for lichen products. <em>Journal of Chromatography<\/em> <strong>238<\/strong>: 483-487.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Elix, JA<\/strong> (2022) <em>Catalogue of standardized chromatographic data and biosynthetic relationships for lichen substances<\/em>. Sixth Edition. Published by the author, Canberra, available for download <a href=\"https:\/\/www.anbg.gov.au\/abrs\/lichenlist\/TLC%20Cat%206MC.pdf\">here<\/a>.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Huneck S, Yoshimura I<\/strong> (1996) <em>Identification of Lichen Substances<\/em>. Springer, Heidelberg.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Orange, A, James, PW &amp; White, FJ<\/strong> (2001) <em>Microchemical methods for the identification of lichens<\/em>. British Lichen Society, London.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Orange, A, James, PW &amp; White, FJ<\/strong> (2010) <em>Microchemical methods for the identification of lichens, second edition with additions and corrections<\/em>. British Lichen Society, London.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson CF<\/strong> (1969) <em>Chemical and botanical guide to lichen products<\/em>. Chapel Hill. University of North Carolina Press.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson CF<\/strong> (1976) Supplement to chemical and botanical guide to lichen products. <em>Bryologist <\/em><strong>73<\/strong>: 177-377.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Culberson, CF, Culberson, WL, Johnson A<\/strong> (1977) <em>Second supplement to chemical and botanical guide to lichen products<\/em>. Missouri Botanical Garden. St. Louis.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Mietzsch E, Lumbsch HT, Elix JE<\/strong> (1994) WINTABOLITES (Mactabolites for Windows). Users manual and computer program, 2nd ed. Universit\u00e4t Essen.<\/p>\n\n\n\n<p><strong>Arup U, Ekman S, Lindblom L, Mattsson JE<\/strong> (1993) High performance thin layer chromatography (HPTLC), an improved technique for screening lichen substances. <em>Lichenologist <\/em><strong>25<\/strong>(1): 61-71.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Identificaci\u00f3n de Metabolitos Secundarios Liqu\u00e9nicos por Cromatograf\u00eda en Capa Fina (CCF) Frank Bungartz1,2,3, Alba Y\u00e1nez-Ayabaca3,4,5 y Mar\u00eda de los \u00c1ngeles Herrera-Campos6 1Biodiversity Integration Knowledge Center, Arizona State University, PO Box 874108, Arizona State University, Tempe, AZ 85287-4108, USA2Charles Darwin Foundation for the Galapagos Islands, Puerto Ayora, Ecuador3Instituto Nacional de Biodiversidad (INABIO), Quito, Ecuadorfrank.bungartz@asu.edu 4Universidad Central <a href=\"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/es\/flujo-de-trabajo-para-la-analisis-de-metabolitos-secundarios\/\" class=\"more-link\">&#8230;<span class=\"screen-reader-text\">  Flujo de Trabajo para la An\u00e1lisis de Metabolitos Secundarios de L\u00edquenes<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":2,"featured_media":0,"parent":0,"menu_order":8,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"footnotes":""},"class_list":["post-2530","page","type-page","status-publish","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/2530","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/users\/2"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=2530"}],"version-history":[{"count":31,"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/2530\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":2717,"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/2530\/revisions\/2717"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/help.lichenportal.org\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=2530"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}